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荧光抗体的制备

核心导读:(一)免疫球蛋白的提取 (二)荧光素 1.荧光色素的基本条件 (1)具有化学活性基团,如异硫氰基(-NCS)等,易与免疫球蛋白结合形成共价键。 (2)对免疫球蛋白无毒性,不影响抗体活性。 (3)荧光效应高,与蛋白结合需要量少。 (4)荧光素性能稳定,结合

  (一)免疫球蛋白的提取

  (二)荧光素

  1.荧光色素的基本条件

  (1)具有化学活性基团,如异硫氰基(-NCS)等,易与免疫球蛋白结合形成共价键。

  (2)对免疫球蛋白无毒性,不影响抗体活性。

  (3)荧光效应高,与蛋白结合需要量少。

  (4)荧光素性能稳定,结合物性能稳定,容易贮藏。

  (5)结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用,易于观察判定。

  到目前为止,基本符合上述要求的荧光素只有异硫氰酸荧光素(FITC),丽丝胺罗丹明B200(RB200)。

  2.常用的荧光色素

  (1)异硫氰酸荧光素:又称异硫氰酸荧光黄,纯品为橙黄色粉末。分有结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度大、稳定、优于粉末型。分子式C21H11O2N5、分子量389,溶于水,易溶于pH8-9.5碳酸盐缓冲液中。最大吸收波长为495nm。最大发射波长520nm。异硫氰酸荧光黄性质稳定,于低温下可保存二年以上,但久置标记抗体能力弱,荧光亮度差,故应采用新产品。

  异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸(主要是赖氨酸)的氨基结合。一个IgG分子有86个氨基酸残基,一般最多能标记16~20个荧光素分子。

  (2)丽丝胺罗丹明:为褐色粉末,不溶于水、易溶于酒精和丙酮。荧光为桔红色。性质稳定,可长期保存。分子式C23H29O7NaS2,分子量为580,最大吸收波长570nm,最大发射波长为600nm。

  由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低,一般不单独使用,多用于与FITC标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。此染料不能直接与蛋白质结合,必须先用五氯化磷(PCl5)处理,使染料的-SO3Na基变为-SO3Cl基后,才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合,形成稳定的硫氨键。

  (三)标记方法

  异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种:

  1.搅拌法

  (1)取一定量的纯IgG液,用0.5Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。

  (2)按荧光素与蛋白质比1?20~1?100(一般用1?100)称取异硫氰酸荧光素,用pH9.5碳酸盐缓冲液溶解。

  (3)将球蛋白液置于电磁搅拌器上,启动开关,轻轻搅拌,以不起沫为准。逐滴加入荧光素液(约10min~15min加完)。加完后,随时用试纸测定搅拌液的pH值,若低于9.0,则应以碳酸钠溶液调整。置4℃搅拌6h~12h即可。

  2.透析法

  (1)将IgG液以0.5Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释成1%浓度,装入透析袋中。

  (2)将荧光素配成0.1mg/ml,其量为1%蛋白液的10倍,装入烧杯中。

  (3)将透析袋置于烧杯中,放电磁搅拌器上4℃搅拌24即可。

  透析法的优点是标记均匀,非特异性荧光少,但所标记的时间长,荧光素的用量多,约比搅拌法多10倍。

  3.影响标记的因素

  (1)荧光素与蛋白质的比值:这也取决于荧光素的质量与保存期。一般而言,粉末状荧光素以0.025mg/mg~0.05mg/mg蛋白质为宜,而结晶型则只需0.006mg/mg~0.008mg/mg蛋白质即可。

  蛋白含量以20mg~25mg/ml为宜,浓度过低标记过慢。浓度过高,标记效果不好。不过在实践中,以稍高一些蛋白浓度为好。

  (2)pH值:以pH9.0~9.5为最好。过低标记速度慢,过高蛋白质容易变性。

  (3)温度和时间:温度4℃~25℃均可。温度与时间是成正比的,温度低,反应慢,温度高,反应快。4℃需要6h~12h,7℃~9℃需要3h~4h,20℃~25℃只需要1h~2h。实践中可自选。透析法还是以4℃较长时间反应为好。

  (4)荧光素的质量及有效期。

  (四)标记抗体的纯化

  标记后溶液是一个混合体,它包括蛋白质与荧光素的结合体,还有游离的荧光素、游离的蛋白质以及结合过多的蛋白质。对于某些细菌性的诊断荧光抗体,则只要去除游离的荧光素即可。对于一般组织染色荧光抗体,则要去除过度标记的抗体即可。只是对某些特殊要求的组织染色试剂,则必须经过仔细的处理,包括具有特异性交叉反应或非特异性反应性的除去。

  1.去除游离的荧光素

  (1)透析法:将标记好的抗体放入透析袋中于0.01Mol/LpH7.6PBS中或生理盐水中4℃透析数天,每天换液数次,直至透析液中无游离色素为止。通常约需5~7天才能透析完毕。

  (2)凝胶过滤:以G25或G50葡聚糖凝胶装柱进行过滤。次法速度快,一般1h~2h即可完成。也可以先透析4h~5h,让大部分游离荧光素除去,再过G25或G50柱。

  2.去除过度标记的蛋白质分子可采用DEAE?纤维素过柱法。利用阶梯洗脱法进行,具体方法如下:

  (1)以0.01Mol/LpH7.6PB液洗脱。

  (2)以0.01Mol/LpH7.6PBS液(0.05Mol/LNaCl)洗脱。

  (3)以0.01Mol/LpH7.6PBS(0.1Mol/LNaCl)洗脱。

  (4)以0.01Mol/LPH7.6PBS(0.2Mol/LNaCl)洗脱。

  收集每部分有荧光抗体的洗脱液管,高中历史,于495nm测荧光素的OD值,再于280nm测蛋白的OD值,查标准曲线,算出各管荧光素和蛋白质的浓度,并计算出F/P比值(见后介绍),将合格者合并,浓缩后分装小瓶备用。

  层析柱上滞留的过度标记的蛋白质,可用1Mol/L的NaCl洗脱。

  3.去除交叉反应等非特异性染色因素非特异性染色的干扰因素,包括免疫血清的不纯、类属抗原以及荧光色素的质量不高、标本处理不当等。可以以脏粉进行吸收。具体做法如下:于每ml标记抗体中加入脏器干粉(脏粉制法见附录)100mg,充分混合,于室温中振荡约1h,然后以10000r/min离心30min,吸取标记抗体。必要时可减半脏粉用量再处理一次。

  经过脏粉吸收后的荧光抗体必须加0.1%叠氮钠防腐(注意不能加硫柳汞,因为重金属对荧光素有影响)。分装小瓶冷冻保存。

  (五)标记抗体的鉴定

  1.F/P比值鉴定荧光色素与球蛋白的结合率即为F/P比值。分别制备荧光色素与蛋白质的标准曲线。

  异硫氰酸荧光素的标准曲线是以0.5Mol/LpH9.5的碳酸盐缓冲液分别配成0.25μg/ml、0.5μg/ml.、0.75μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml……10.0μg/ml的浓度,在495nm波长测其OD值,按重量与OD值在坐标上制成标准曲线。

  蛋白的标准曲线是将牛血清蛋白分别配成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml…1.6mg/ml,在280nm测其OD值,并绘制成曲线。按以下公式计算F/P比值:

  1.6×104FITCμg/mlFITCμg/ml

  F/P(克分子比值)=×=0.41×

  390抗体mg/ml抗体mg/ml

  式中1?6×104为抗体蛋白质的分子量,390为异硫氰酸荧光素分子量。

  F/P克分子比值以1~2为合适,1~3.5为合格。比值过低敏感性差,比值过高,易出现非特异性反应。用于检查组织细胞抗原成分,F/P以1~2为好;用于检查细菌涂片时,F/P以2~3为好。

  2.免疫电泳测定通过免疫电泳可以测定荧光抗体的免疫纯度。要求在球蛋白的部位上只出现一条沉淀线。

  3.染色性能的鉴定包括测定荧光抗体的敏感性与特异性。

  (1)荧光抗体效价的测定:将荧光抗体倍比稀释,然后用已知抗原制片,分别用各稀释度去染色,观察“++”荧光强度的最大稀释倍数即为该荧光抗体的染色滴度(或单位)。实际应用时则取2个或3个单位做应用的稀释度。

  (2)荧光抗体的特异性试验:为了确保荧光抗体的特异性,必须预先进行下列试验。①阳性标本染色试验:即用所制荧光抗体去染色已知的相应的抗原,结果应是阳性;②阴性标本染色试验:即用所制荧光抗体去染色已知的非相应抗原,结果应是阴性;③类属性抗原染色试验:取与已知抗原相近的类属抗原(如炭疽杆菌与枯草杆菌或类炭疽杆菌等),用荧光抗体染色,应为阴性,说明特异性强,如不同程度地出现有荧光,说明具有类属反应,特异性不强等;④抗体吸收试验:以过量的相应抗原加入荧光抗体中,感作2h~4h,4℃过夜,离心取上清再对相应抗原染色,应无荧光或荧光显著消退;⑤染色阻抑试验:用未标记的抗体对相应抗原进行染色,冲洗后,再用荧光抗体对相应抗原进行染色,结果观察,应无荧光。阻抑试验应注意抗体与抗原的相应比例,未标记抗体的比例过小,结果抗原结合有剩余,标记抗体仍能被结合而显示出阻抑不全。当抗体比例过大,则抗体的一个结合点结合而表现出不牢固,极易被标记抗体所置换出来而又显示出阻抑不全。

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